基因敲除在工业微生物育种方面的应用

微生物育种技术的发展先后经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种5个阶段,其中基因工程育种技术中的基因敲除技术具有定位性强、经修饰和改造的基因能够随染色体DNA的复制而稳定地复制的特点,使人们可以有目的地去改造生物的遗传物质,从而达到微生物育种的目的,受到人们的广泛关注。就基因敲除技术的几种主要方法及其在改良工业生产菌株中的应用作简要介绍。     

分子标记辅助改良杂交稻协优57及其父母本的蒸煮食味品质

协优57是一个产量高和适应性强的杂交中籼组合,但由于其父母本直链淀粉含量（AC）高,导致杂交稻米的AC较高、蒸煮食味品质较差。先前利用PCR-AccⅠ分子标记辅助选择对协优57的亲本057[恢复系,记作057（GG）]和协青早A[不育系,记作协A（GG）]的W x基因进行改良。利用改良前、后的各亲本分别配组,分析不同组合的AC、食味品质和颗粒性淀粉结合酶（GBSS）活性。结果表明,改良单亲的GT型组合协A（GG）×057（TT）、协A（TT）×057（GG）杂交稻米的AC由原组合协A（GG）×057（GG）的28%分别降到19.9%和19.3%,但均一性较差。改良双亲的TT纯合型组合协A（TT）×057（TT）的杂交稻米,不仅AC降到中等偏低水平（13.1%）,而且AC的均一性也有了很大的提高,蒸煮食味品质明显改善。GBSS活性分析表明：三种W x基因型的GBSS活性总体表现为GG〉GT〉TT。     

microRNA在人类免疫缺陷病毒感染中的作用

microRNA(miRNA)对调控基因表达有着重要作用,病毒与宿主在miRNA水平存在着复杂的"对话"。研究显示,人类免疫缺陷病毒(HIV)可能编码病毒miRNA(vmiRNA),通过维持病毒潜伏、保护感染细胞免于凋亡或外力刺激下的细胞死亡等方式,在HIV病理过程中发挥重要作用。宿主miRNA则参与到了抗HIV的防御性机制中,但也面临HIV调控相应宿主miRNA、编码RNA沉默抑制物等多种阻力。深入研究HIV与宿主间miRNA水平上的动态相互作用,有助于进一步了解HIV的致病机理,开发新的治疗策略。     

Caveolin-1真核表达载体的构建及其Hepa1-6细胞中的表达

Caveolin-1在不同肿瘤中发挥作用不同,既发挥抑癌基因样作用又发挥癌基因样作用.旨在分析caveolin-1 在小鼠肝癌细胞系中的表达情况及建立稳定表达外源caveolin-1的Hepa1-6细胞.利用RT-PCR和Western-blot方法检测caveolin-1在小鼠肝癌H22、Hea-F和Hepa1-6细胞中的表达;通过分子克隆构建小鼠caveolin-1 cDNA真核表达栽体,利用脂质体转染等方法建立稳定表达外源caveolin-1的Hepa1-6细胞株;通过RT-PCR、Western-blot、免疫细胞化学等方法鉴定其稳定表达细胞株.结果显示,caveolin-1在Hepa1-6细胞中表达呈阴性,在H22和Hca-F 中高表达;成功获得小鼠caveolin-1 cDNA真核表达载体pEGFP-N2/Cav-1,筛选并鉴定出高表达外源caveolin-1的Hepa1-6稳定细胞株C1和C4,为进一步分析caveolin-1在肝癌中所发挥的作用奠定了一定的研究基础.     

动物病理学在新药开发风险控制中的作用

目的 进行临床前研究的主要原因在于,保证研究中新药探索实验中尤其是研发早期试验人群的安全,因为只是减少健康志愿者身上的风险无益于保证（所有）受试者的安全.内容 本文从新药研发的两个阶段分别对病理学在临床前风险控制研究中的作用进行了讨论.结论 在非临床前新药研发阶段的风险控制中,让病理学家参与到新药研发的风险管理队伍中来,帮助研发、监控研发,是成功研发与优良的风险管理策略相衔接的关键.     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

带时间延迟的Cohen-Grossberg神经网络全局鲁棒稳定性的一个结果（英文）

在本文中,我们讨论了一类带时间延迟的Cohen-Grossberg神经网络,并研究了这个系统平衡点的全局鲁棒稳定性。利用Lyapunov函数,我们得出了全局鲁棒收敛性的几个充分条件。这些条件以线性矩阵不等式（LMI）的形式表达。因此,从计算的角度出发他们是高效的。另外,这些条件不依赖于时间延迟和神经网络的激发函数。     

HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性。方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析。结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL。两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致。定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P〈0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P〈0.05,直线正相关程度较低。结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIVp27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期（5年）的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴（G0401V→G0402V→0403V）,同时,剔除G0401V猴CD8＋T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴（G0401V→G0404V）,应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4＋T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8＋T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠的心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠,研究Calponin 1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Calponin 1转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western Blot检测Calponin 1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠的心脏结构和功能,HE染色和Masson染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 Calponin 1在野生型小鼠心脏中有表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏组织表达降低。通过显微注射法,建立了2个心脏组织Calponin 1基因高表达的转基因小鼠系。与野生型小鼠相比,Calponin 1转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）增加28%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室内径（LVID,diastolic）增加16.2%（P〈0.01,n=12）,收缩期左室后壁厚度（LVPW,systolic）减小15.7%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室后壁厚度（LVPW,diastolic）减小21%（P〈0.01,n=12）,射血分数（ejection fraction,EF）降低11.5%（P〈0.01,n=12）,短轴内径缩短率（fraction shortening,FS）降低14.6%（P〈0.05,n=12）。转基因小鼠心脏组织病理H＆E染色和Masson染色显示,转基因小鼠心室扩张,心肌细胞不均匀肥大,细胞间隙变大,心肌间质纤维增多。结论 Calponin 1在心脏特异过表达引起转基因小鼠心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,心室壁变薄,射血分数及短轴缩短率降低等扩张性心肌病表型,推测Calponin 1是参与心肌病病理发生的基因之一。